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- Title
Plant pyruvate-dependent gamma-aminobutyrate transaminase: identification of an Arabidopsis cDNA and its expression in Escherichia coli.
- Authors
Van Cauwenberghe, Owen R; Makhmoudova, Amina; McLean, Michael D; Clark, Shawn M; Shelp, Barry J
- Abstract
Both pyruvate- and 2-oxoglutarate-dependent gamma-aminobutyrate transaminase (GABA-T) activities are present in crude tobacco (Nicotiana tabacum L.) leaf extracts. In this study, GABA:pyruvate-T activity was partially purified using mitochondrial isolation and protein solubilization in 3-[3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate, and a combination of chromatographic and electrophoretic procedures. A partial amino acid sequence of the putative 55-kDa GABA-T subunit enabled identification of a predicted Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. GABA:pyruvate-T expressed sequence tag and subsequent amplification of a 1515 bp open reading frame encoding a 504-amino acid polypeptide. Computer analysis using web-based tools revealed the presence of a putative mitochondrial signal sequence and a pyridoxal-5-phosphate binding domain in the polypeptide. Functional expression of the GABA-T cDNA in Escherichia coli revealed that the recombinant protein uses pyruvate but not 2-oxoglutarate. The Arabidopsis GABA:pyruvate-T cDNA could form the basis for identification of multiple GABA-T isoforms and generation of GABA-T mutants for determining the fate of GABA nitrogen and elucidating the physiological function of GABA in plants.Key words: amino acceptor, gamma-aminobutyrate, gamma-aminobutyrate transaminase, protein purification, heterologous expression, recombinant protein.Les activités de la gamma-aminobutyrate transaminase dépendantes du pyruvate aussi bien que du 2-oxoglutarate (GABA-T), se retrouvent dans les extraits bruts de feuilles de tabac (Nicotianum tabacum L.). Les auteurs ont partiellement purifié l'activité du GABA:pyruvate-T, par isolement des mitochondries et solubilisation des protéines dans le 3-[3-cholamidopropyl)diméthylammonio]-1-propanesulfonate, avec une combinaison de traitements chromatographiques et électrophorétiques. Une séquence partielle des acides aminés du présumé GABA-T de 55-kDa a rendu possible l'identification d'un marqueur séquentiel prédit du GABA:pyruvate-T chez l'Arabidopsis thaliana (L.) Heyhn., et l'identification subséquente d'un cadre de lecture ouvert de 1515-pb codant pour un polypeptide de 504 acides aminés. L'analyse par ordinateur à l'aide de logiciels disponibles sur le web (toile) révèle dans le polypeptide, la présence d'une présumée séquence de signaux mitochondriens et d'un domaine liant le pyridoxal-5-phosphate. L'expression fonctionnelle du cADN du GABA-T dans l'Escheria coli montre que la protéine recombinante utilise le pyruvate, mais pas le 2-oxoglutarate. Le cADN du GABA-T pourrait constituer une base pour l'identification de multiples isoformes du GABA-T, et la génération de mutants du GABA-T pour déterminer le sort de l'azote du GABA en élucidant la fonction physiologique du GABA chez les plantes.Mots clés : amino récepteur, gamma-aminobutyrate, gamma-aminobutyrate transaminase, purification des protéines, expression hétérologue, protéine recombinate.[Traduit par la Rédaction]
- Subjects
DNA; ARABIDOPSIS; ESCHERICHIA coli; RECOMBINANT proteins; GENETICS
- Publication
Canadian Journal of Botany, 2002, Vol 80, Issue 9, p933
- ISSN
0008-4026
- Publication type
Article
- DOI
10.1139/b02-087