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- Title
In‐situ‐Synthese von hochdichten RNA‐Mikroarrays mittels Photolithographie.
- Authors
Lietard, Jory; Ameur, Dominik; Damha, Masad J.; Somoza, Mark M.
- Abstract
Obwohl hochdichte DNA‐Mikroarrays bereits seit drei Jahrzehnten etabliert sind, stellte sich die Synthese des RNA‐Pendants bis jetzt als sehr schwierig dar. Im Folgenden beschreiben wir die erste In‐situ‐Synthese von hochdichten RNA‐Mikroarrays als Basengemisch, mithilfe von Photolithographie und lichtempfindlichen Phosphoramiditen. Mit einer Kopplungseffizienz, die mit der von DNA‐Monomeren vergleichbar ist, können nun RNA‐Oligonukleotide mit einer Mindestlänge von 30 Nukleotiden unter Verwendung von modifizierten Phosphoramiditen effizient hergestellt werden. Ein zweistufiges Protokoll ermöglicht die Abspaltung der Schutzgruppen des Phosphodiesters, der exozyklischen Amine und des 2′‐Hydroxyls. Qualität und Identität der oberflächengebundenen RNA werden durch Hybridisierung und enzymatische Assays verifiziert. Wir zeigen durch die Synthese einer komplexen RNA‐Bibliothek, die durch Permutation 262 144 einzigartige Sequenzen enthält, dass eine hohe Anzahl von Oligonukleotiden auf kleiner Fläche hochdicht synthetisiert werden kann. Wir stellen ebenso chimäre DNA/RNA‐Mikroarrays vor und erkunden mögliche Anwendungen durch Kartierung der Sequenzspezifität von RNase HII. In situ hergestellte RNA‐Mikroarrays können als leistungsstarke Plattformen für groß angelegte Struktur‐ und Funktionsstudien von Ribonukleinsäuren gesehen werden. Die Nukleotide haben sich geändert: Mithilfe von Photolithographie, Phosphoramiditchemie und einem neuen Set von Basen‐empfindlichen Monomeren, können ab jetzt basengemischte RNA‐Mikroarrays in situ synthetisiert werden. Das ≈1.5 cm2 kleine Syntheseareal eines hochdichten RNA‐Arrays kann bis zu 780 000 verschiedene Sequenzen unterbringen. Das Konzept wird durch die Synthese aller möglichen 9‐nt‐Sequenz‐Permutationen veranschaulicht.
- Publication
Angewandte Chemie, 2018, Vol 130, Issue 46, p15477
- ISSN
0044-8249
- Publication type
Article
- DOI
10.1002/ange.201806895