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- Title
Folding pathway for partially folded rabbit muscle creatine kinase.
- Authors
Park, Yong-Doo; Ou, Wen-Bin; Yu, Tian-Wei; Zhou, Hai-Meng
- Abstract
Rabbit muscle creatine kinase (CK) was modified by 5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) accompanied by 3 M guanidine hydrochloride denaturation to produce a partially folded state with modified thiol groups. The partially folded CK was in a monomeric state detected by size exclusion chromatography, native-polyacrylamide gel electrophoresis, circular dichroism, and intrinsic fluorescence studies. After dithiothreitol (DTT) treatment, about 70% CK activity was regained with a two-phase kinetic course. Rate constants calculated for regaining of activity and refolding were compared with those for CK modified with various treatments to show that refolding and recovery of activity were synchronized. To further characterize the partially folded CK state and its folding pathway, the molecular chaperone GroEL was used to evaluate whether it can bind with partly folded CK during refolding, and 1-anilinonaphthalene-8-sulfonate was used to detect the hydrophobic surface of the monomeric state of CK. The monomeric state of CK did not bind with GroEL, although it had a larger area of hydrophobic surface relative to the native state. These results may provide different evidence for the structural requirement of GroEL recognition to the substrate protein compared with previously reported results that GroEL bound with substrate proteins mainly through hydrophobic surface. The present study provides data for a monomeric intermediate trapped by the modification of the SH groups during the refolding of CK. Schemes are given for explaining both the partial folding CK pathway and the refolding pathway.Key words: creatine kinase; partially folded state; reactivation; refolding; GroEL; intermediate.La créatine kinase (CK) de muscle de lapin a été modifiée par le 5,5'-dithio-bis(acide 2-nitrobenzoïque) et une dénaturation par le chlorhydrate de guanidine 3 M afin qu'elle soit partiellement repliée et ait des groupes thiol modifiés. La CK partiellement repliée est un monomère selon la chromatographie d'exclusion, l'électrophorèse en gel de polyacrylamide, le dichroïsme circulaire et l'étude de la fluorescence intrinsèque. Après un traitement au DTT, environ 70% de l'activité de la CK peut être rétablie selon une cinétique en deux phases. Les constantes de vitesse calculées pour le rétablissement de l'activité et le repliement ont été comparées à celles de la CK modifiée par divers traitements afin de montrer que le repliement et le rétablissement de l'activité sont synchronisés. Dans le but de mieux caractériser la CK partiellement repliée et la voie de repliement, nous avons déterminé si le chaperon moléculaire GroEL peut se lier à la CK partiellement repliée au cours du repliement et nous avons détecté la surface hydrophobe de la CK monomérique à l'aide du 1-anilinonaphtalène-8-sulfonate. Les résultats montrent que la CK monomérique ne se lie pas à GroEL, même si elle a une surface hydrophobe plus grande qu'à l'état natif. Ces résultats peuvent fournir des informations sur les caractéristiques structurales essentielles pour que GroEL reconnaisse le substrat protéique qui soient différentes des résultats antérieurs selon lesquels GroEL se lie aux substrats protéiques principalement par l'intermédiaire de leurs surfaces hydrophobes. La présente étude fournit des données en faveur d'un intermédiaire monomérique retenu à la suite de la modification de groupes -SH durant le repliement de la CK. Des mécanismes sont proposés pour expliquer à la fois la voie de formation de la CK partiellement repliée et la voie de repliement.Mots clés : créatine kinase, état de repliement partiel, réactivation, repliement, GroEL, intermédiaire.[Traduit par la Rédaction]
- Subjects
CREATINE kinase; PHOSPHOTRANSFERASES; RABBITS; ANIMALS; BIOLOGY
- Publication
Biochemistry & Cell Biology, 2001, Vol 79, Issue 4, p479
- ISSN
0829-8211
- Publication type
Article
- DOI
10.1139/o01-129