We found a match
Your institution may have access to this item. Find your institution then sign in to continue.
- Title
Candidate-gene cloning and targeted marker enrichment of wheat chromosomal regions using RNA fingerprinting - differential display.
- Authors
Gill, Kulvinder S; Sandhu, Devinder
- Abstract
The usefulness of the RNA fingerprinting – differential display technique in gene cloning and targeted marker enrichment in wheat is demonstrated. A small region of chromosome 5BL was targeted that contains Ph1, a chromosome-pairing regulator gene. The cultivar Chinese Spring (CS) and mutant ph1b are almost identical except for chromosome 5BL, which, in the mutant line, carries an interstitial deletion encompassing the Ph1 gene. Poly(A)[sup +] RNA of the two lines from anthers at developmental stages ranging from pre-meiotic mitosis to anaphase II was PCR-amplified using 38 pairwise combinations of 19 primers. The [sup 35] S-labeled amplified products were size-separated on denaturing polyacrylamide-urea gels. A total of 3154 fragment bands were observed, of which 43 were present in CS but absent in the ph1b mutant. These 43 fragment bands were eluted, re-amplified, and used as probes in gel-blot DNA analyses of wheat group 5 nullisomic-tetrasomic lines and the ph1b mutant. Twenty-four of these 43 probes were single- or few-copy sequences. Eight of the 24 probes mapped to wheat group 5 and five mapped to the deletion of the ph1b mutant. Three of these five probes were further localized to the submicroscopic region containing the Ph1 gene, by using two deletion lines flanking the region. Northern-blot analysis revealed that the gene corresponding to one of these three probes expresses mainly during meiosis and is from the B genome.Key words: RNA fingerprinting – differential display, wheat, gene cloning, marker enrichment, Ph1 gene.L'utilité de l'approche combinant les empreintes d'ARN et l'affichage différentiel (« RNA fingerprinting – differential display ») pour des fins de clonage et d'identification sélective de marqueurs est illustrée ici. Une petite région du chromosome 5BL contenant le gène Ph1, un régulateur de l'appariement chromosomique, a été ciblée. Le cultivar Chinese Spring (CS) et un mutant ph1b sont pratiquement identiques à l'exception du chromosome 5BL, le mutant ayant une délétion qui comprend le gène Ph1. L'ARN poly(A)[sup +] des deux lignées a été extrait des anthères à divers stades allant de la mitose pré-méiotique à l'anaphase II et amplifié par PCR à l'aide de 38 combinaisons de 19 amorces. Les produits d'amplification marqués au [sup 35] S ont été séparés sur gels dénaturants de polyacrylamide-urée. Au total, 3154 bandes ont été observées dont 43 qui étaient présentes chez CS mais absentes chez ph1b. Ces 43 fragments ont été élués, réamplifiés et employés comme sonde dans des analyses Southern sur des lignées nullisomiques-tétrasomiques pour les chromosomes du groupe 5 et sur le mutant ph1b. Vingt-quatre de ces 43 sondes détectaient des séquences présentes en une ou quelques copies seulement. Huit des 24 sondes ont été cartographiées sur les chromosomes du groupe 5 et cinq des sondes provenaient de régions délétées chez le mutant ph1b. Trois de ces cinq sondes ont de plus été assignées à une région submicroscopique contenant le gène Ph1 en utilisant deux lignées ayant des délétions bordant cette région. Des analyses Northern ont révélé que le gène correspondant à l'une de ces trois sondes s'exprime principalement lors de la méiose et en provenance du génome B.Mots clés : empreintes d'ARN – affichage différentiel, blé, clonage de gènes, enrichissement pour des marques, gène Ph1.[Traduit par la Rédaction]
- Subjects
MOLECULAR cloning; FORENSIC genetics techniques; GENETIC markers; DNA probes; CULTIVARS
- Publication
Genome, 2001, Vol 44, Issue 4, p633
- ISSN
0831-2796
- Publication type
Article
- DOI
10.1139/g01-047