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- Title
His-391 of β-galactosidase (Escherichia coli) promotes catalyes by strong interactions with the transition state.
- Authors
Huber, Reuben E; Hlede, Isabel Y; Roth, Nathan J; McKenzie, Kyle C; Ghumman, Kiran K
- Abstract
His-391 of β-galactosidase (Escherichia coli) was substituted by Phe, Glu, and Lys. Homogeneous preparations of the substituted enzymes were essentially inactive unless very rapid purifications were performed, and the assays were done immediately. The inactive enzymes were tetrameric, just like wild-type β-galactosidase and their fluorescence spectra were identical to the fluorescence spectrum of wild-type enzyme. Analyses of two of the substituted enzymes that were very rapidly purified to homogeneity and rapidly assayed while they were still active (at only a few substrate concentrations so that the data could be rapidly obtained), showed that the kinetic values were very similar to the values obtained with the same enzymes that were only partially purified. This showed that the kinetics were not affected by the degree of purity and allowed kinetic analyses with partially purified enzymes so that large numbers of points could be used for accuracy. The data showed that His-391 is a very important residue. It interacts strongly with the transition state and promotes catalysis by stabilizing the transition state. Activation energy differences (DDG[sub s] [sup ‡] ), as determined by differences in the k[sub cat] /K[sub m] values, indicated that substitutions for His-391 caused very large destabilizations (22.8-35.9 kJ/mol) of the transition state. The importance of His-391 for transition state stabilization was confirmed by studies that showed that transition state analogs are very poor inhibitors of the substituted enzymes, while inhibition by substrate analogs was only affected in a small way by substituting for His-391. The poor stabilities of the transition states caused significant decreases of the rates of the glycolytic cleavage steps (galactosylation, k[sub 2] ). Degalactosylation (k[sub 3] ) was not decreased to the same extent.Key words: β-galactosidase, mechanism, transition state, binding, histidine, catalysis.Le résidu His-391 de la β-galactosidase (Escherichia coli) a été remplacé par un résidu Phe, Glu, ou Lys. Les enzymes substituées purifiées jusqu'à homogénéité sont inactives à moins qu'elles soient purifiées très rapidement, et que les dosages subséquents soient faits immédiatement. Les enzymes inactives sont des tétramères, comme la β-galactosidase de type sauvage et leurs spectres de fluorescence sont identiques à celui de l'enzyme de type sauvage. Les études cinétiques de deux des enzymes substituées purifiées jusqu'à homogénéité très rapidement et dosées rapidement (à seulement quelques concentrations de substrat afin d'obtenir les résultats rapidement) donnent des valeurs très semblables à celles obtenues avec les mêmes enzymes purifiées que partiellement. Cela montre que les cinétiques ne sont pas modifiées par le degré de pureté, ce qui permet d'effectuer les études cinétiques avec les enzymes partiellement purifiées afin d'obtenir de nombreux points pour plus de précision. Les résultats montrent que le résidu His-391 est très important. Il interagit fortement à l'état de transition et il favorise la catalyse en stabilisant l'enzyme dans l'état de transition. Les différences d'énergie d'activation (DDG[sub s] [sup ‡] ) calculées à partir des différences des valeurs de k[sub cat] /K[sub m] indiquent que les substitutions de l'His-391 engendrent une très forte déstabilisation (22,8-35,9 kJ/mol) de l'état de transition. L'importance de l'His-391 pour la stabilisation de l'état de transition est confirmée par des études montrant que des analogues de l'état de transition sont de très mauvais inhibiteurs des enzymes substituées, alors que l'inhibition par des analogues du substrat n'est que légèrement affectée par une substitution de l'His-391. Le peu de stabilité des états de transition entraînent une diminution significative de la vitesse des étapes de l'activité glycolytique (galactosylation, k[sub 2] ). La dégalactosylation (k[sub 3] ) est moins diminuée.Mots clés : β-galactosidase, mécanisme, état de transition, liaison, histidine, catalyse.[Traduit par la Rédaction]
- Subjects
ESCHERICHIA coli; ENZYMES; PROTEINS; GENETICS; BIOLOGY
- Publication
Biochemistry & Cell Biology, 2001, Vol 79, Issue 2, p183
- ISSN
0829-8211
- Publication type
Article
- DOI
10.1139/o00-101