We found a match
Your institution may have access to this item. Find your institution then sign in to continue.
- Title
Towards high affinity carbohydrate-binding proteins: Directed evolution of murine galectin-3.
- Authors
Lundquist, Joseph J; Kiburz, Brendan M; Wu, Jeffrey K; Gibbs Jr., Kenneth D; Toone, Eric J
- Abstract
Towards a better understanding of the molecular basis of affinity, a directed evolution of murine galectin-3 (G3) was initiated to produce mutants with improved affinity for lactose and N-acetyllactosamine relative to the wild-type protein. A series of N-terminal truncations were developed to facilitate incorporation of the 35 kDa protein into a phage-display construct. Analysis of the various assemblies revealed that all such deletions produced protein unsuitable for use in directed evolution studies. Following fusion of the full-length galectin to p3 of filamentous phage, three libraries were constructed and biopanned for increased affinity for lactose. The first two libraries, of 1 × 10[sup 5] and 1 × 10[sup 6] members, respectively, were assembled through a combination of error-prone PCR and DNA shuffling. A third library was constructed using a modified staggered extension protocol (StEP), but contained only 10 members. Mutants were also engineered site-specifically to test the role of key residues in or near the binding pocket. Analysis of the mutants by ITC identified one mutation (R158G) that produces a twofold increase in affinity for lactose and another that results in a sixfold increase in affinity for N-acetyllactosamine. Solid-phase binding analysis of phage for nonexpressing proteins indicated that two other mutants demonstrated increased binding to β-methyllactose relative to the wild-type protein. Together these studies validate the evolutionary approach and set the stage for the development of novel carbohydrate-binding proteins.Key words: phage display, directed evolution, galectin, thermodynamics, carbohydrates.Dans le but de mieux comprendre les bases moléculaires de son affinité, on a initié une évolution dirigée de la murine-galectine-3 (G3) afin de produire des mutants ayant une meilleure affinité que la protéine naturelle pour le lactose et la N-acétyllactosamine. On a développé une série de produits tronqués au niveau N-terminal qui permettent de mieux incorporer la protéine de 35 kDa dans un assemblage présentant le phage. Une analyse de divers types d'assemblage a permis de découvrir que de tels tronquaqes conduisent à une protéine qui n'est pas appropriée pour un usage dans des études d'évolution dirigée. À la suite d'une fusion de la galectine complète à un p de 3 à un phage filamenteux, on a préparé trois banques et dont on a évalué d'un point de vue biologique le degré d'affinité pour le lactose. Les deux premières banques qui comprennent respectivement 1 × 10[sup 5] et 1 × 10[sup 6] membres ont été assemblées par le biais d'une combinaison PCR et de réarrangement d'ADN qui est sujette à erreur. La troisième bibliothèque a été obtenue en faisant appel à un protocole d'extension décalé modifié (« StEP »), mais elle ne comportait que 10 membres. On a aussi préparé des mutants à spécification de site pour évaluer le rôle des résidus clés dans ou près de la poche de fixation. L'analyse des mutants par ITC a permis d'identifier une mutation (R158G) qui permet de doubler l'affinité pour le lactose et une autre qui multiplie par six cette affinité pour la N-acétyllactosamine. Une analyse de la fixation du phage en phase solide pour des protéines qui ne donnent pas d'expression indique que deux autres mutants possèdent un pouvoir de fixation accru pour le β-méthyllactose par rapport à la protéine naturelle. Ces études considérées ensemble permettent de valider l'approche évolutionnaire et de mettre tout en place le développement de nouvelles protéines pouvant se lier à des hydrates de carbone.Mots clés : mise en évidence du phage, évolution dirigée, galectine, thermodynamique, hydrates de carbone. [Traduit par la Rédaction]
- Subjects
CHEMICAL affinity; LACTOSE; PROTEINS; GENETIC mutation; CARBOHYDRATES; CARRIER proteins
- Publication
Canadian Journal of Chemistry, 2002, Vol 80, Issue 8, p999
- ISSN
0008-4042
- Publication type
Article
- DOI
10.1139/v02-086