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- Title
Gene cloning, protein purification, and enzymatic properties of multicopper oxidase, from Klebsiella sp. 601.
- Authors
Yang Li; Jiao Yin; Guosheng Qu; Luchao Lv; Yadong Li; Sheng Yang; Xing-Guo Wang
- Abstract
A gene encoding a putative multicopper oxidase (MCO) was cloned from the soil bacterium Klebsiella sp. 601 and its corresponding enzyme was overexpressed in an Escherichia coli strain. Klebsiella sp. 601 MCO is composed of 536 amino acids with a molecular mass of 58.2 kDa. Theoretical calculation gave a pI value of 6.11. The amino acid sequence of Klebsiella sp. 601 MCO is strongly homologous to that of E. coli CueO with a similarity of 90% and an identity of 78%. Unlike E. coli CueO, Klebsiella sp. 601 MCO contains an extra 20 amino acids close to its C-terminus. The enzyme was purified to homogeneity by Ni-affinity chromatography. The purified enzyme was capable of using DMP (2,6-dimethoxyphenol), ABTS (2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazolinesulfonic acid)), and SGZ (syringaldazine) as substrates with an optimal pH of 8.0 for DMP, 3.0 for ABTS, and 7.0 for SGZ. Klebsiella sp. 601 MCO was quite stable at pH 7.0 in which its activity was constant for 25 h without any significant change. Kinetic studies gave Km, kcat, and kcat//Km values of 0.49 mmol/L, 1.08 × 103 s-1, and 2.23 × 103 s-1·mmol/L-1, respectively, for DMP, 5.63 mmol/L, 6.64 × 103 s-1, and 1.18 × 103 s-1·mmol/L-1 for ABTS, and 0.023 mmol/L, 11 s-1, and 4.68 × 102 s-1·mmol/L-1 for SGZ. Un gène codant une oxydase multi-cuivre (OMC) présumée a été cloné chez la bactérie du sol Klebsiella sp. 601 et l’enzyme correspondante a été surexprimée chez Escherichia coli. L’OMC de Klebsiella sp. 601 est composée de 536 acides aminés et possède une masse moléculaire de 58,2 kDa. Selon un calcul théorique, la valeur de pI est de 6,11. La séquence en acides aminés de l’OMC de Klebsiella sp. 601 est fortement homologue à la séquence de CueO de E. coli, avec une similarité de 90 % et une identité de 78 %. Contrairement à la CueO d’E. coli, l’OMC de Klebsiella sp. 601 contient 20 acides aminés supplémentaires à proximité de l’extrémité C-terminale. L’enzyme a été purifiée à homogénéité par chromatographie d’affinité sur Ni. L’enzyme purifiée pouvait utiliser le DMP (2,6-dimethoxyphenol), l’ABTS (2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazolinesulfonic acid)) et le SGZ (syringaldazine) comme substrats avec un pH optimal de 8,0 pour le DMP, de 3,0 pour l’ABTS et de 7,0 pour le SGZ. L’OMC de Klebsiella sp. 601 était relativement stable à pH 7,0 où son activité était constante pendant 25 h, sans changement significatif. Des études cinétiques ont généré des valeurs de Km, kcat et Km/kcat de 0,49 mmol/L, 1,08 × 103 s-1 et 2,23 × 103 s-1·mmol/L-1 respectivement pour le DMP, 5,63 mmol/L, 6,64 103 s-1 et 1,18 × 103 s-1·mmol/L-1 pour l’ABTS et de 0,023 mmol/L, 11 s-1 et 4,68 × 102 s-1·mmol/L-1 pour le SGZ.
- Subjects
KLEBSIELLA; MOLECULAR cloning; ENTEROBACTERIACEAE; ESCHERICHIA coli; OXIDASES; AMINO acids; AMINO acid sequence; CHROMATOGRAPHIC analysis; MICROBIOLOGY
- Publication
Canadian Journal of Microbiology, 2008, Vol 54, Issue 9, p725
- ISSN
0008-4166
- Publication type
Article
- DOI
10.1139/W08-063